ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это прямой метод выявления возбудителя, то есть с помощью него можно определить РНК вируса со слизистой ротоглотки или носоглотки, то есть можно определить сам коронавирус. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований.
Что такое ПЦР анализ
| Секвенирование нуклеиновых кислот | 6) автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа Метод ПЦР в реальном времени основан на детектировании сигнала флуоресценции, позволяющем наблюдать процесс накопления продукта в процессе реакции. |
| Методы диагностики ВИЧ-инфекции: сроки и достоверность исследований | Диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) показывает наличие половых инфекций с очень большой точностью. |
| Мутации врозь: ПЦР-тесты научились отличать «Омикрон» от «Дельты» | Статьи | Известия | Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. |
ПЦР в режиме реального времени – новейшие технологии в диагностике инфекций
Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом.
Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы.
Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации загрязнения материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР. Словарь ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов.
У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в проверенных лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы. Исследуемый биоматериал Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала[9].
Выбор зависит от типа инфекции. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы.
Для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты. Для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость. Подготовка к исследованию Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала[10].
Яна Гудина У Регины Рубеновны проходила комплексное обследование. И знаете, впервые для меня поход к гинекологу не был проблематичным. Все аккуратно, тактично, по человечески. Осталась очень довольна и уровнем и ценой. Большое спасибо! Алексей Л. Спасибо Роману Александровичу Гусейнову за помощь и понимание!
Отличный врач, профессионал своего. С большим желанием помогает, и всячески поддерживает. Рад, что попал именно к нему. С болезнью справились совместными усилиями, сейчас периодически у него наблюдаюсь. Валентин Юдашевич Отличная клиника! Хороший уровень, лечился у Гусейнова Романа Александровича. Хороший врач, выслушал, задал много вопросов, назначил необходимые анализы. После готовности по анализам опередил диагноз и назначил необходимое лечение, которое помогло.
ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний. ПЦР — уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа — небольшое количество любого биоматериала пациента. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена. Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена возбудителя опасных заболеваний , хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров — отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» — многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя. Преимущества метода ПЦР Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Исключен риск ложноположительных результатов.
ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
Последнее возможно, если коронавируса там не было изначально попал в организм иным путем, например, через кровь. Бывает, что в носоглотке возбудитель не оседает, а сразу продвигается в легкие и выявляется только на компьютерной томографии. Экспресс-тест на коронавирус Экспресс-тест можно сделать в домашних условиях. Он не предполагает лабораторных исследований, не требует специального оборудования. Достаточно купить набор в аптеке. Например, к Standard Q Covid-19 прилагается подробная инструкция.
Для проведения экспресс-теста на коронавирус понадобятся: стерильный тампон человек берет у себя мазок сам ; одноразовая кассета в индивидуальной упаковке; пробирка с реактивом; насадка с капельницей. При наличии инфекции в организме контакт биоматериала с реактивом приводит к окрашиванию контрольной полоски. Результат появляется через 20-30 минут. Наибольшую точность тест показывает в первую неделю после заражения. В дальнейшем повышается вероятность получения ложноотрицательного результата.
Для уточнения диагноза лучше сделать ПЦР-тест. Анализ на антитела к коронавирусу Анализ на антитела к коронавирусу показывает не присутствие инфекции в организме, а ответ иммунной системы на нее. В ответ на заражение она вырабатывает несколько типов иммуноглобулинов: IgA являются реакцией непосредственно на коронавирус; IgM синтезируются при наличии инфекции в организме указывают на острое течение заболевания ; IgG появляются, когда тело «запоминает» вирус и формирует иммунитет к нему. Недостаточно, чтобы антитела были просто выявлены. Нужно смотреть и на их комбинацию.
Сдать такой анализ нужно, чтобы узнать, вырабатывает ли организм антитела к вирусу, а если да, то сколько. Тесты на антитела Разные виды тестов на антитела к коронавирусу проводятся дома или в лаборатории. В лаборатории берут кровь из вены и выполняют количественную оценку вырабатываемых иммуноглобулинов. Домашний тест покажет, есть ли антитела в принципе. Сколько их вырабатывается, с его помощью узнать нельзя: для этого требуются познания в биохимии и специальное оборудование для подсчета.
В этом случае достаточно капиллярной крови из пальца.
Этот процесс называется ПЦР с обратной транскрипцией. Обнаружение вирусной РНК с помощью ПЦР позволяет обеспечить диагностику COVID-19 на ранней стадии - до того, как организм выработает ответ в виде антител или даже до того, как у человека появятся симптомы заболевания. Тесты ПЦР играют решающую роль в предотвращении распространения заболеваний, так как часто позволяют выявить инфекции на ранней стадии, еще до появления симптомов. Количественный ПЦР-анализ позволяет оценить инфекционную нагрузку на организм, а также используется для анализа изменений экспрессии генов в опухолях. Важна также и высокая скорость проведения исследования. В отличие от традиционного посева при выявлении бактериальных инфекций, который занимает несколько дней, ПЦР тест обычно выполняется в течение суток.
Это значительно увеличивает вероятность назначения своевременного лечения. Кроме того, с помощью ПЦР можно определить латентных носителей инфекции. Необходимо строго соблюдать правила сбора биоматериала и его хранения. Важно выбрать правильное время взятия биоматериала и выполнить правила подготовки к тесту. В частности, это касается и нового коронавируса, который присутствует в выделениях носоглотки и ротоглотки только в течение определенного времени, по истечении которого анализ окажется отрицательным. Кроме того, высокая чувствительность ПЦР может иногда превращаться из преимущества в недостаток.
На этапе детекции результат амплификации ВКО позволяет судить о качестве результата при проведении ПЦР-анализа в целом. Хотя использование эндогенного внутреннего контроля — тоже вариант, все же лучше всего использовать экзогенный внутренний контроль — ВКО на основе РНК. Экзогенный внутренний контроль добавляется непосредственно перед выделением РНК, проходит все стадии и, если в результате ПЦР-анализа мы видим сигнал от ВКО, это свидетельствует о том, что результат анализа можно принимать во внимание.
Если же сигнала нет, то результат анализа недействителен. Современная тест-система без внутреннего контрольного образца — это абсурд. Тем не менее почти половина! Конечно, ранее в условиях внезапной пандемии и нехватки времени, это можно было оправдать.
Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.
Именно этот фермент катализирует и "контролирует" все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента - он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а "любимый" его температурный режим во время работы - 72оС. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре. С момента появления метода, ПЦР-исследования завоевывают все большую и большую популярность. Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет избежать ошибок и ложноположительных результатов, связанных с контаминацией и значительно ускорить получение результата.
ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится?
Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация (то есть многократное увеличение) фрагментов ДНК в биоматериале.
Микробиологические исследования
| Актуальные методы диагностики COVID-19 | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – современный метод исследования, основанный на увеличении малых концентраций фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. |
| Метод ПЦР диагностики: сферы применения, подготовка к исследованию, анализы на инфекции | Молекулярно-биологические исследования с применением метода полимеразной цепной реакций (ПЦР). |
| Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности | Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. |
| ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике | Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ. |
| Микробиологические исследования | При самолечении и самостоятельной сдаче анализов для исследования методом ПЦР в сетевой лаборатории высок риск того, что вы будете годами лечиться от несуществующей болезни. |
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
• При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром. Как проводится ПЦР-диагностика, когда назначают исследование с помощью этого метода и как подготовиться к анализу. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе. это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Если первоначальное тестирование является отрицательным, но подозрение на COVID-19 сохраняется, предлагается повторить тест, т. В таких случаях ВОЗ также рекомендует тестирование образцов из нижних дыхательных путей, если это возможно. Применение мер предосторожности в борьбе с COVID-19 должно продолжаться, пока проводится повторная оценка. Во многих случаях из-за ограниченной доступности тестирования и озабоченности по поводу ложноотрицательных результатов диагноз COVID-19 предполагается на основе клинической картины в условиях возможного контакта проживание или поездка в регион неблагоприятный по распространению инфекции или при известном контакте. В таких случаях, особенно у госпитализированных пациентов с отрицательными тестами на РНК SARS-CoV-2, характерные лабораторные данные или результаты визуализирующих методов диагностики могут дополнительно подтвердить клинический диагноз COVID-19 и стать причиной применения профилактических мер. Практикующий врач должен согласовать с лабораторией дальнейшее исследование.
В борьбе с вирусами человек может твёрдо рассчитывать только на свой иммунитет, а возможности противовирусных средств сильно ограничены. Именно когда дело касается вирусов, становится особенно актуальной методика ПЦР в режиме реального времени.
Вирусная нагрузка или виремия — это степень тяжести поражения организма вирусом. Показатель рассчитывается путём определения числа вирионов в биологическом материале, измеряется в МЕ или в количестве копий на 1 мл крови и служит для контроля над ходом терапии и предупреждения распространения вируса. Но и в случае с другими вирусами определение нагрузки может оказаться полезным — например, когда речь идёт о цитомегаловирусе, герпесе или папилломовирусе. Анализ поможет понять, грозит ли человеку очередное обострение болезни, и насколько высока вероятность передачи инфекции. ВИЧ-инфицированным людям назначается антиретровирусная терапия. Её цель — максимально снизить вирусную нагрузку, а в идеале — сделать её неопределяемой. Но даже в этом случае существует риск заразить своего полового партнёра или партнёршу, поэтому не следует пренебрегать использованием презервативов.
При выборе типа биоматериала для диагностики врачи ориентируются на специфику инфекции, на её излюбленную локализацию. Ведь от того, попадет ли вредоносная ДНК в пробу, зависит то, будет ли получен достоверный результат анализа. Для ПЦР берутся следующие материалы: Мазок или эпителиальный соскоб со слизистых оболочек. Это может быть уретра, влагалище, шейка матки, цервикальный канал, задний проход, ротовая, носовая и даже глазная полость. Мазки наиболее актуальны при диагностике заболеваний, передающихся половым путём. Для взятия мазка или соскоба используются зонды с разными наконечниками; Кровь из вены берут, когда нужно обнаружить ВИЧ, гепатит, цитомегаловирус, мононуклеоз или какое-либо заболевание бактериальной этиологии, например, сифилис, холеру или боррелиоз; Биологические жидкости моча, слюна, сперма, мокрота, секрет предстательной железы, желудочный сок, плевральная, суставная, спинномозговая или амниотическая жидкость, а также бронхоальвеолярный лаваж берутся по показаниям. Например, ПЦР-анализ мокроты используется при диагностике туберкулёза; Пунктаты и биоптаты органов и тканей, как правило, берутся при подозрении на онкологию.
Исключение составляет биопсия желудка, которую проводят для определения наличия Helicobacter pylori — бактерии, вызывающей гастрит и язвенную болезнь.
Метод ПЦР используется в нескольких вариантах. Наиболее часто используемый тип сегодня - это так называемый ПЦР в реальном времени. Генетический материал вируса SARS-CoV-2 обнаруживается в мазке, взятом из дыхательных путей чаще всего из носоглотки или одновременно из горла и слизистой оболочки носа. Затем в лабораторных условиях образец размножается и анализируется. ПЦР - более чувствительный тест, чем исследование на антиген, поскольку он может обнаружить одну молекулу РНК в микролитрах раствора. В настоящее время это золотой стандарт диагностики коронавируса.
Этап идентификации размноженного генетического материала Собственно ПЦР на этом заканчивается и далее идет не менее значимый этап идентификации. Для идентификации используют метод электрофореза или меченые «затравки». При использовании электрофореза полученные нити ДНК разделяются по размерам, и наличие фрагментов ДНК разной длины свидетельствует о положительном результате анализа то есть о наличии того или иного вируса, бактерии и т. При использовании меченых «затравок», к конечному продукту реакции добавляют хромоген краситель , вследствие чего ферментативная реакция сопровождается образованием окраски. Развитие окраски прямо свидетельствует, что вирус или другой выявляемый агент присутствуют в исходной пробе. На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР. Это так называемаяreal-time ПЦР. Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью? Однако, эти преимущества должны базироваться на непременном соблюдении следующих условий: корректный забор, транспортировка биологического материала; наличие стерильного, одноразового инструментария, специальных лабораторий и обученного персонала; строгое соблюдение методики и стерильности во время проведения анализа Чувствительность различается для различных выявляемых микробов.
Возможности, заложенные в ПЦР-анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности. Это означает выявление именно того микроорганизма, который искали, а не похожего или близкородственного. Диагностическая чувствительность и специфичность метода ПЦР, зачастую превосходят таковые и для культурального метода, называемого «золотым стандартом» для выявления инфекционных заболеваний.
Цепная реакция. Как работают тесты на коронавирус?
Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл. ПЦР с анализом результатов по конечной точке (End-point PCR) – это модифика-ция метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуо-ресценции после амплификации. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — это точный метод лабораторной диагностики, который используют для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки.
Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
В 1953 г. Эта их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией. Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. ПЦР стала действительно недорогой и технологичной методикой в результате использования ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus, обитающей в трубопроводах горячей воды.
Универсальным носителем генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов является дезоксирибонуклеиновая кислота ДНК. Исключение составляют только некоторые микроорганизмы, например, вирусы, носителем генетической информации у которых является РНК — одноцепочечная рибонуклеиновая кислота. ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль.
Каждая нить состоит из последовательности химически связанных нуклеотидов.
Для исследования берут мазок из носоглотки и ротоглотки, после чего пробу направляют в лабораторию, где методом ПЦР определяют наличие либо отсутствие генетического материала коронавируса. Если в пробе РНК коронавируса его не обнаружили, то это означает, что на момент взятия мазка пациент не инфицирован. Метод ПЦР отличается более высокой чувствительностью, чем экспресс-тест, и информативен для выявления всех известных штаммов коронавируса, включая «омикрон». В редких случаях пациенты с симптомами COVID-19 или его бессимптомные носители могут получить отрицательный результат теста.
Это возможно при низкой вирусной нагрузке слишком малое количество вируса в верхних дыхательных путях , поздних стадиях заболевания, когда у пациента уже поражены лёгкие вирус «спустился» из носоглотки в лёгкие , и при неправильном взятии мазка.
Бактериологический метод бакпосев Бакпосев — метод диагностики ЗППП путем выращивания микробов в благоприятной для этого среде. Он является золотым стандартом в определении инфекций, поскольку выявляет не только вирус, но и его активность.
Преимуществом данного метода является возможность не только выявить бактерию, но и возможность получить антибиотикограмму, на основе которой врач назначает точное лечение. Наиболее часто бакпосев используют для диагностики уреаплазмоза, микопламзоза, трихомониаза, хламидиоза, различных форм кандидоза. Правила сдачи анализа на бакпосев: за сутки не спринцеваться, не пользоваться вагинальными свечами; за сутки до анализа воздержаться от половых контактов; за неделю прекратить прием антибиотиков; не опорожнять мочевой пузырь за 1,5-2 часа.
Молекулярная диагностика ПЦР ПЦР-диагностика, или полимеразная цепная реакция, направлена на определение специфической нуклеотидной последовательности участка ДНК возбудителя инфекции внутри клетки, чего нельзя добиться при мазке или бакпосеве. ПЦР-анализ часто используется для выявления: хламидиоза, уреаплазмоза, микоплазмоза, гениального герпеса, гонореи, трихомониаза. Данный метод способен выявить возбудителя даже на стадии инкубационного периода, однако он не дает представления об активности вируса, как это дает ИФА.
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» в нее входит, он и разработал тесты, которыми пользуются в лабораториях Роспотребнадзора. То есть производит тесты «Вектор», а проводят тестирование региональные центры Роспотребнадзора. У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший. Гамалеи , компания «ДНК-технология». И это хорошо, когда есть разные тест-системы, их можно сравнить, проверить результаты одной с помощью другой. На первом заседании координационного совета по борьбе с коронавирусом вице-премьер РФ Татьяна Голикова сказала, что правительство ждет от регионов предложений о том, на базе каких еще лабораторий можно будет проводить эти исследования. Частные компании тоже смогут делать тесты на коронавирус на платной основе.
Возможно, в самом скором времени будет новая информация о том, как все это будет происходить. Это много для наших масштабов или мало? Мало нам будет пользы и от миллиона тестов, если не хватит рук, чтобы эти тесты запускать. Все эти вопросы надо исследовать. В чем их принципиальные отличия? Почему государство выбрало именно те, что сделали в «Векторе»? Если эта РНК исчезнет в процессе, не даст сигнала, значит, что-то пошло не так. Это знак, что могла исчезнуть и вирусная РНК, а стало быть, отрицательный результат следует считать ложноотрицательным.
Про остальные тест-системы поговорим, когда они получат регистрационные удостоверения.