Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это современный инструмент диагностики разнообразных инфекций, отличающийся высокой точностью. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – метод, который позволяет выявить присутствие вируса в организме. Информационно-аналитический портал о молекулярной диагностике и смежных областях науки и практики: молекулярной биологии и медицине.
ПЦР: метод, который слишком хорош
Диагностика COVID-19: обзор основных методов | Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре). |
ПЦР: простыми словами о принципе работы, применении и новых технологиях | – Большинство генетических тестов, которые вошли в широкую практику, основаны на принципе полимеразной цепной реакции. |
Азбука жизни. Зачем в онкологии нужны ПЦР-тесты и какую информацию о болезни хранит в себе ДНК | Суть полимеразной цепной реакции заключается в том, что берется малое количество материала для исследования, содержащего ДНК, а в процессе ПЦР происходит увеличение количества генетического материала, принадлежащего конкретному возбудителю и, таким. |
Важные сведения об использовании продукции BIOplastics в ПЦР и Real Time ПЦР анализах | это метод создания тысяч копий цепи ДНК. |
Борьба с поддельными ПЦР-тестами разводит руками | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе. |
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
ПЦР-роботы, занятые в столь масштабном проекте по секвенированию, как «Геном человека», неумолимо трудятся с огромными объемами термостойкой полимеразы. Некоторые ученые, работающие в проекте «Геном человека», были возмущены неоправданно высокими отчислениями, которые добавляет к стоимости расходных материалов владелец патента на ПЦР, европейский индустриально-фармацевтический гигант Hoffmann-LaRoche. Другим «движущим началом» стал сам метод секвенирования ДНК. Химическая основа этого метода в то время уже не была новинкой: Межгосударственный проект «Геном человека» HGP взял на вооружение тот же самый хитроумный метод, что еще в середине 1970-х годов разработал Фред Сенгер. Инновация же заключалась в масштабе и степени автоматизации, которых удалось достичь при секвенировании.
Автоматическое секвенирование исходно разрабатывалось в лаборатории Ли Худа в Калифорнийском технологическом институте. Он заканчивал школу в штате Монтана и играл в американский футбол на позиции нападающего; благодаря Худу команда не раз выигрывала чемпионат штата. Навыки командного взаимодействия пригодились ему и в научной карьере. В лаборатории Худа трудилась пестрая компания химиков, биологов и инженеров, и вскоре его лаборатория вышла в лидеры по части технологических инноваций.
Фактически метод автоматического секвенирования изобрели Ллойд Смит и Майк Хункапиллер. Майк Хункапиллер, который тогда работал в лаборатории Худа, обратился к Ллойду Смиту, предложив ему усовершенствованный метод секвенирования, в котором основания каждого типа окрашивались бы каждый в свой цвет. Такая идея могла в четыре раза повысить эффективность сенгеровского процесса. У Сенгера при секвенировании в каждой из четырех пробирок по числу оснований при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность.
Далее в пробирки добавляли формамид для расхождения цепей и проводили электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. В варианте Смита и Хункапиллера дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определенном месте геля возбуждает активность красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Полная версия по клику — 4,08 МБ Мелким шрифтом: последовательность ДНК, расшифрованная с использованием автоматического секвенатора, полученная из аппарата для автоматического секвенирования.
Ход реакции Амплификация может включать в себя множество циклов, но все они состоят из трёх этапов: денатурация, отжиг, элонгация [1]. Денатурация — процесс перехода двухнитевой формы ДНК в однонитевую из-за разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований при воздействии высоких температур. Отжиг — процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит благодаря правилу комплементарностиЧаргаффа. Без соблюдения этих условий праймеры не отжигаются. Элонгация синтез. Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы. Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации. В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются: ПЦР с «горячим» стартом hot-start PCR — суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров.
ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа. ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» End-point PCR — эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени. Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Мультиплексная мультипраймерная ПЦР — амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т. Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования. Комплект необходимого оборудования для проведения ПЦР должен включать в себя все необходимые приборы для выделения НК, их амплификации и детекции результатов.
Все оборудование должно быть исправным, иметь технический паспорт и инструкцию по эксплуатации. Все приборы должны соответствовать нормам безопасности. Для предотвращения контаминации исходных образцов используют одноразовые пробирки с плотно закрывающимися крышками и наконечники к микродозаторам, термостаты с твердотельнымтермоблоком, специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок. Смена наконечников является обязательной после каждой проведенной манипуляции [3]. Для каждого отдельного помещения предусмотрено наличие холодильников и морозильников для поддержания определенной температуры, вортексов и ротаторов для перемешивания, центрифуг различной мощности для перемешивания и разделения образцов. Также необходимо наличие комплекта дозаторов различного диапазона объемов и подходящих для них наконечников, штативов для микропробирок, самих микропробирок центрифужных, градуированных и пр. Все комнаты должны быть оснащены бактерицидными рецикуляторами для дезинфекции воздуха при помощи УФ, все рабочие поверхности и наружные поверхности корпусов приборов должны быть устойчивы к дезинфекции. Помимо перечисленного списка каждая зона лаборатории должны содержать конкретный набор приборов, необходимых для выполнения соответствующих задач. Организация зон лаборатории представлена на схеме [4].
Зона приема, регистрации и первичной обработки материала должна быть оборудована центрифугами для осаждения и разделения компонентов проб.
Технология пришлась кстати в условиях всеобщей паники по поводу недавно открытого СПИДа. Муллис и тут занял особую воинственную позицию. Он утверждал, что иммунодефицит вызывается не только вирусом, который назвали ВИЧ, но и рядом других ретровирусов. Эта теория не получила признания и Кэри прослыл парией. Тем более, что он ещё сомневается в связи между деятельностью человека и глобальным потеплением. ДНК-полимераза, направляющая сила полимеразной цепной реакции Вверху слева: фермент полимераза за работой, строительство комплементарной цепочки ДНК, свивающейся в двойную спираль.
А взялся он из Большого Фонтана, знаменитого гейзера в Йеллоустонском национальном парке. У Муллиса оставалась нерешенной проблема: полимераза, копирующая ДНК — это часть бактерии. При нагревании выходит из строя и полимераза. Поэтому после каждой процедуры удвоения фрагмента ДНК приходилось открывать пробирку, охлаждать смесь и капать в неё свежий фермент. Корпорация «Ситес» бросила целый отдел на изыскание полимеразы, устойчивой к высокой температуре. Вспомнили о термофильной палочке Thermus aquaticus, открытой в гейзере 15 годами ранее. Правда, при температуре выше 80 она погибает, но фермент более получаса не теряет активности при 95 градусах.
Эта полимераза не портится при каждом цикле нагревания-охлаждения-нагревания: её можно поместить в пробирку до начала реакции, закрыть в амплификаторе наглухо и предоставить остальное автоматике. Однажды Муллису позвонил его бывший научный руководитель Джо Нейландс и сказал, что если Кэри хотя бы на время придержит язык и перестанет распространяться насчёт ВИЧ, ему в ближайшее время присудят Нобелевскую премию по химии. Так и случилось. Не без замирания сердца ждали члены комитета это выступление. А ну как он примется сводить счёты с бывшими работодателями, или что-нибудь антинаучное ляпнет про СПИД. Но Кэри Муллис вышел на трибуну совсем с иной целью. Сначала насмешил аудиторию.
В ход пошли космический лягушонок, «Эврика» на дороге, ведёрко пино нуар. Перед объяснением сути своего открытия лауреат просил прощения за то, что «сейчас будет сложновато». Но сложного ничего не было. Рассказ летел как на крыльях; всё с юмором, и даже первая неудача была забавна. Когда же дошло до первого успеха, голос Кэри дрогнул. Провал 9-10 сентября не смутил Муллиса, потому что померк на фоне проблем в личной жизни. Дженнифер больше не любила его.
В декабре, чтобы не встречать вместе Рождество, она взяла отпуск и улетела к матери на Восточное побережье. Это был окончательный разрыв. Видя горе Муллиса, его новый сотрудник, молодой математик Фред Фалуна, помог во внеурочное время наладить «железо» и софт для нового эксперимента. И вот им удалось размножить в 1024 экземплярах фрагмент хорошо известной плазмиды pBR322, которая кодирует устойчивость кишечной палочки к антибиотикам. Исторический опыт 16 декабря 1983 года пришёлся на день рождения Синтии, третьей жены Муллиса. Это она когда-то поощряла его литературные опыты, и родила от него двух прекрасных сыновей. Как получилось, что он оставил подругу юности ради взбалмошной женщины, с которой два года прошли в непрерывном выяснении отношений?
В тот день Кэри Муллис понял, что такое трагедия. Это тяжёлое личное переживание, с которым ты остался один на один. Муллис решил зайти в гости к Фреду и что-нибудь вместе приготовить, устроить вечеринку. На том Нобелевская лекция и заканчивается. Вот её последние слова: «У меня подкашивались ноги, когда я вышел и направился к своей серебристой Хонде Сивик, которая всегда безотказно заводилась.
И дело совсем не в том, что на севере Калифорнии особенные дороги, способствующие озарению; просто его друг однажды видел, как Муллис безрассудно мчался по обледенелой дороге с двусторонним движением и это его совершенно не смущало. Друг рассказал New York Times следующее: «Муллису привиделось, что он погибнет, врезавшись в секвойю. Поэтому он ничего не боится за рулем, если вдоль дороги не растут секвойи». Наличие секвой вдоль дороги заставляло Муллиса сосредоточиться и… вот оно, озарение. За свое изобретение в 1993 году Муллис получил Нобелевскую премию по химии и с тех пор стал еще более странным в своих поступках. Например он является сторонником ревизионистской теории о том, что СПИД не связан с ВИЧ, чем значительно подорвал собственную репутацию и помешал врачам. ПЦР — довольно простая реакция. Для ее проведения нам требуется два химически синтезированных праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Праймеры — это короткие участки однонитчатой ДНК, каждый примерно по 20 пар оснований в длину. Особенность праймеров такова, что они соответствуют участкам ДНК, которые требуется амплифицировать, то есть ДНК-матрице. Изображение кликабельно Кэри Муллис, изобретатель ПЦР Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка. Фактически полученная «матрица» представляет собой цельный геном, и наша цель — выделить из нее интересующие нас фрагменты. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Фермент ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки или примера для копирования. В результате первого цикла получаем многократное последовательное удвоение определенного участка ДНК.
ПЦР: метод, который слишком хорош
Борьба с поддельными ПЦР-тестами разводит руками | ПЦР — полимеразная цепная реакция, способная обнаружить любой патоген в пробе, если там присутствует хотя бы малейшая его частица. |
Кэри Муллис и полимеразная цепная реакция (ПЦР) | ДРАЙВ | Цифровая полимеразная цепная реакция (цПЦР) представляет собой биотехнологическое усовершенствование традиционных методов полимеразной цепной реакции. |
Создана тест-система для диагностики кори - Российская газета | Принцип полимеразной цепной реакции Слева: упрощённая схема удвоения ограниченного праймерами фрагмента молекулы ДНК в процессе ПЦР, с диапазонами рабочих температур каждой стадии. |
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) | Анализ тестовых палочек от ПЦР-тестов на COVID в больнице в Словакии подтверждает геноцид. |
ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет всего в течение нескольких часов обнаружить возбудителя инфекции, причем выявить можно даже 1-2 молекулы среди огромного количества. |
Важные сведения об использовании продукции BIOplastics в ПЦР и Real Time ПЦР анализах
Цифровая полимеразная цепная реакция (цПЦР) представляет собой биотехнологическое усовершенствование традиционных методов полимеразной цепной реакции. На данный момент метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) регла-ментирован стандартами оказания медицинской помощи в перечне лабо-раторных исследований для диагностики хламидийной инфекции. Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Азбука жизни. Зачем в онкологии нужны ПЦР-тесты и какую информацию о болезни хранит в себе ДНК | medium ПЦР (Полимеразная цепная реакция) Если попытаться описать ПЦР-диагностику в трёх словах, то это, совершенно определённо, будут слова ТОЧНО, НАДЁЖНО, БЫСТРО. |
Ложноположительный ПЦР: Почему так бывает? | Введение При проведении такой высокочувствительной и при этом высокоспецифичной реакции, коей является полимеразная цепная реакция (ПЦР), иногда случаются как ложно-позитивные, так и ложно-негативные результаты, что представляет серьезную проблему. |
Цепная реакция: топ-инноваций на рынке тестирования методом ПЦР | Полимеразная цепная реакция (ПЦР). |
Диагностика инфекций методом ПЦР: что это такое?
ОТ-ПЦР — это разновидность ПЦР, то есть полимеразной цепной реакции. Информационно-аналитический портал о молекулярной диагностике и смежных областях науки и практики: молекулярной биологии и медицине. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).
ПЦР: простыми словами о принципе работы, применении и новых технологиях
Именно поэтому результат теста имеет диагностическую значимость в совокупности с другими данными, клиническими признаками, эпидемиологическим анамнезом, результатами рентгенологической диагностики или компьютерной томографии. Если при отрицательном результате подозрение на коронавирусную инфекцию сохраняются, на приеме терапевта — врач назначает повторное обследование. ПЦР-диагностика рекомендована таким категориям населения: людям, имеющим симптомы COVID-19, длительное время повышенную температуру, сухой кашель и пр. Тест на антитела к COVID-19 При вторжении в организм патогенного агента иммунная система начинает вырабатывать специфические белки-иммуноглобулины Ig , способные запомнить и нейтрализовать этот микроорганизм. Таким образом, повторная встреча с данным возбудителем будет неопасна. Организм быстро его инактивирует.
IgM обнаруживаются в анализе на 7-10 день после инфицирования с 5-го дня появления клинических признаков заболевания и остаются в организме до двух месяцев. Поскольку иммуноглобулины начинают вырабатываться не с первого дня инфицирования, то и тест на антитела сначала может быть отрицательным, ведь исследование может проводиться в период, когда организм еще не успел сформировать иммунный ответ. Логично обнаружить IgM в разгар заболевания и сразу после регресса симптоматики.
Даже если в исследуемом материале присутствует всего один фрагмент генетического материала возбудителя, тест все равно показывает его. В ходе диагностики выявляют уникальную последовательность нуклеотидов в цепочке ДНК, характерную только для конкретного патогенного микроорганизма, провоцирующего развитие заболевания. Высокую скорость выполнения. Для установки реакции достаточно несколько часов. Пациент получает результаты анализа на следующий день после сдачи. ПЦР-тест направлен на определение возбудителя заболевания, а не на реакцию на его проникновение со стороны организма. Показания к проведению ПЦР-теста Анализ проводят при инфекционных заболеваниях для определения природы их возбудителя.
Настоящее злоупотребление заключается в том, что вам не нужно его использовать для тестирования вируса ВИЧ или других, порядка 10 000 безымянных ретровирусов, которые тоже присутствуют. Понимаете, если у кого-то есть ВИЧ то, как правило, у него окажется почти всё на что вы его протестируете. ПЦР позволяет сделать мизерное количество чего-то измеримым и затем обсуждать важность этого вопроса на встречах. Это не злоупотребление, а скорее не правильное толкование. Яблоко это яблоко. Если у вас есть достаточное количество чего-то что похоже на яблоко, то собрав всё в одну кучу можно считать это яблоком. В случае с ВИЧ это не так, тесты на вирус ВИЧ основаны на вещах не видимых и результаты представляют собой предположение в каком-то смысле. ПЦР это не то же самое, это просто процесс с помощью которого можно сделать из малого количества чего-то целую кучу. Он не может установить, болен ты или нет.
Или окажется ли для тебя опасным то, что там у тебя нашли или нет». Указанное подтверждает и практика, приведу пару известных случаев, но следует учитывать, что их, гораздо больше. Ковид у папаи. Танзанийский лидер уволил директора национальной лаборатории здравоохранения Ньямбура Мореми. Его специалисты обнаружили коронавирус у странных пациентов. Чтобы выяснить, что не так с тестами, каждый образец был особым образом промаркирован, чтобы быть похожим на реальный. На пробирках указали пол и возраст "пациентов". Президент Танзании Джон Магуфули решил проверить присланные в страну тесты для определения ковид. Собрали образцы и направили в лабораторию.
Он оказался негативным. А тест с плода папаи оказался позитивным.
Респираторные заболевания. Диагностика методом ПЦР стала в 2020 году актуальной как никогда и продемонстрировала свою незаменимость и эффективность.
ПЦР-анализ — главный тест и «золотой стандарт» диагностики коронавирусной инфекции Sars-Cov-2 COVID-19 , ставшей причиной самой масштабной пандемии последних десятилетий. Наследственные заболевания и отцовство также диагностируются при помощи метода ПЦР. ПЦР-тесты применяются везде, где нужен быстрый, точный и надежный результат. Подготовка к проведению ПЦР-теста Еще одно немаловажное преимущество ПЦР-анализов — это отсутствие специфической подготовки к проведению тестов.
Достаточно следовать стандартным рекомендациям специалиста: Анализ сдается утром натощак. При этом ряд генетических исследований проводится в произвольное время, удобное пациенту. При сдаче анализа по мазку из ротоглотки необходимо выдержать интервал с приемом пищи и воды в 3-4 часа перед тестом. Перед анализом на венерические инфекции необходимо воздержаться от половой активности в течение суток.
Перед анализом нельзя использовать никакие противовирусные препараты. Подробную инструкцию по правилам подготовки к каждому анализу вы всегда можете получить у лечащего врача или у консультантов на нашей горячей линии. Как проводится ПЦР-анализ С 1983 года, когда был изобретен данный метод, прошло много времени, и технологии не стоят на месте. Сегодня существует несколько различных методик для проведения ПЦР-теста: С обратной транскрипцией.
Самый распространенный способ идентификации известной последовательности РНК, включающий амплификацию, определение патогена и его идентификации среди образцов, хранящихся в научной картотеке. Вложенная ПЦР или «гнездовая» — используется для снижения количества неспецифичных продуктов реакции и имеет две стадии с использованием двух видов праймеров. Изотермические методы — не требуют повторяющихся температурных циклов, менее энергозатратны.
ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом. это новый, усовершенствованный вид ПЦР с использованием метода флуоресценции (свечения). Полимеразная цепная реакция. читайте в нашей статье.
ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
Полимеразная цепная реакция: принцип работы. Несмотря на революционное значение, принцип ПЦР основан на довольно базовых свойствах молекулы ДНК. На каждом бланке результата ПЦР-теста на COVID-19 размещен QR-код. это новый, усовершенствованный вид ПЦР с использованием метода флуоресценции (свечения).