ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей.
Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
Если вам назначили количественный ПЦР-анализ, врач напишет в направлении не только название исследования, но и предпочтительный метод, которым нужно провести ПЦР-анализ. Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа. О сервисе Прессе Авторские права Связаться с нами Авторам Рекламодателям Разработчикам. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
ПЦР анализ: что это такое?
Преимущества МАТ: Главная особенность МАТ — чрезвычайная моноспецифичность против одной антигенной детерминанты и абсолютная однородность. Возможность многократного получения в течение длительного времени воспроизводимость. Неограниченное количество получаемых антител. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы.
Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты. Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа.
Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА.
Еще одним из важнейших современных методов диагностики заболеваний внутренних органов является ДНК-диагностика методом полимеразной цепной реакции. ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его. ПЦР — это циклический процесс, в каждом цикле которого происходит тепловая денатурация двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение коротких олигонуклеотидов-праймеров и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы путем присоединения нуклеотидов.
В результате накапливается большое количество копии исходной ДНК-мишени, которые легко подаются детекции. Открытию полимеразной цепной реакции сопутствовало развитие молекулярно-биологических технологий. Первые данные о химических своиствах ДНК появились в 1868 г.
К началу 50-годов ХХ в. Основания бывают двух типов: пуриновые — аденин и гуанин и пиримидиновые — цитозин и тимин. В 1953 г.
Уотсон и Ф. Крик пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух комплиментарных полимерных цепей, образующих двойную спираль. Согласно модели Уотсона навитые одна на другую цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей.
При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин — с цитозином. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой растущей цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. В 1955 г.
Корнберг открыл в клетках фермент, который назвал ДНК-полимеразой. Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты они используются в качестве строительных блоков. Нуклеотид, который присоединяет ДНК-полимераза, комплементарен основанию в соответствующем положении матричной цепи.
В ходе репарации и репликации двойной спирали ДНК каждая цепь служит матрицей для синтеза другой цепи. В 1962 г.
Преимущества методики ПЦР Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей. Общим для них есть высокая чувствительность для положительного результата достаточно 40! Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов буфера, праймеров, раствора для отмывки и т. Области применения в медицине В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др. А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию. Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ.
Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа. В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит — назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения. Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза болезни Лайма , клещевых энцефалитов. Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни герпес, грибки — по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические — по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого. Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:.
Но полноценно в практику лабораторной диагностики метод ПЦР в нашем центре был внедрен с приобретением амплификаторов, с детекцией в режиме реального времени, с 2003г.
На данный момент метод используется в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» в трех лабораториях: вирусологической, бактериологической и лаборатории особо опасных и природно-очаговых инфекций, по обширному кругу инфекций и для определения содержания ГМО в продуктах питания. В арсенале нашего Центра на сегодняшний день внедрены методики для обнаружения следующих патогенов: инфекции респираторного тракта вирусы гриппа А H1-swine pdm09 , Н5N1, H3N2 , грипп В , коронавирусы , риновирусы, метапневмовирусы, аденовирусы, РС-вирусы, бокавирусы, парагрипп 1,2,3,4 типа особо опасные и природно-очаговые инфекции возбудитель Сибирской язвы, холеры, ГЛПС, лептоспироз, туляремия, бруцеллез, лихорадка Западного мира, клещевой вирусный энцефалит, клещевой боррелиоз, гранулоцитарный анаплазмоз, моноцитарный эрлихиоз, микоплазма пневмония, хламидофила пневмония, возбудитель ТОРС кишечные инфекции норовирусы 1 и 2 геногруппы ,ротавирусы, астровирусы, Шигелла, энтероинвазивные E.
Хотя тесты ПЦР сильно уступают в точности выявления конкретных штаммов, метод может найти применение в части научных исследований, рассказали «Известиям» опрошенные эксперты. Генотипирование методом ПЦР может использоваться только для ориентировочного определения какого-либо из штаммов, — считает руководитель медицинской онлайн-лаборатории Lab4U Валерий Саванович. Исходя из описания, представляется, что данная разработка может быть полезна в период высокой распространенности штамма «Омикрон» в стационарах и поликлиниках, считает директор департамента медицинского маркетинга группы компаний «Инвитро» Татьяна Понкратова. При этом Понкратова подчеркнула, что информация о штамме имеет весьма скромную пользу для самого пациента в отрыве от рекомендаций лечащего врача. Директор по лабораторным технологиям лаборатории «Гемотест» Тамара Силкина отметила, что ЦНИИЭ Роспотребнадзора — организация, которая обязана контролировать эпидемиологическую ситуацию в стране. Для этого и нужно разрабатывать методики быстрого определения опасных штаммов. По ее мнению, новая система поможет контролировать процесс распространения инфекции. Как рассказали в Роспотребнадзоре, методика, разработанная учеными ЦНИИЭ, уже используется с декабря 2021 года для проведения скрининговых исследований поступающих образцов. В настоящее время планируется передать протокол и необходимые реагенты для проведения таких исследований на места в региональные научные организации Роспотребнадзора, сообщили «Известиям» в ведомстве.
Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается интеркалирует плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне 254 - 310 нм. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра 590 нм. В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма. Размер неспецифических ампликонов может быть как больше, так и меньше по сравнению с «положительным контролем». В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные. В то же время препарат ДНК, подготовленный для ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью, для чего используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль», который представляет собой любой стандарт ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда, например, используют р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций пришивают участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы.
Если «внутренний контроль» внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК «внутреннего контроля» в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то, независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, «внутренний контроль» станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных тяжелых , чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси свидетельствует о нормальном прохождении реакции амплификации и отсутствии ингибиторов. Если ампликоны нужного размера и «внутреннего контроля» не образовались, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК. Несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Так, если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с «внутренним контролем» за праймеры. Это принципиально важно при низких концентрациях ДНК в исследуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам. Тем не менее, при условии решения проблемы конкуренции за праймеры этот способ контроля эффективности амплификации, безусловно, будет весьма полезен. Метод горизонтального электрофореза Одним из методов визуализации результатов амплификации является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру.
В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле. Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов. Метод вертикального электрофореза Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза.
Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют. Метод гибридизационных зондов В качестве альтернативы электрофоретическому методу детекции, имеющему некоторые недостатки: субъективность чтения результатов, ограничения по определению ДНК различных микроорганизмов в одной реакции, могут быть предложены гибридизационные схемы детекции. В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды" со специфическим олигонуклеотидным зондом. Регистрация таких комплексов может быть проведена колориметрически или флуориметрически. Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Кинетическая кривая в координатах "Уровень репортерной флуоресценции - цикл амплификации" имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии: 1.
Стадию инициации когда ПЦР-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой. Экспоненциальную стадию в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР. Плато стадию насыщения. По нарастанию интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения, прилагаемого к амплификатору, вычисляется концентрация исходной матрицы ДНК. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4. В настоящее время преимущество ПЦР-анализа перед культуральным методом обнаружения микроорганизмов состоит в следующем:.
Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма.
Они устанавливают часть проб в станции выделения, а с другими работают вручную. После экстракции генерируется задание для амплификаторов, сотрудник загружает планшеты или пробирки и запускает прибор. После окончания амплификации выдаются результаты, которые уже проанализированы, а задача сотрудников — удостовериться в отсутствии ошибок. Вся информация уходит на сервер. Она может остаться на хранении, поступить в ЛИС, или же ее можно напечатать в лабораторный журнал и разослать в кабинеты врачей. В заключение Максим Ионов отметил, что разработанные программные решения позволяют обеспечить поток информации на всех этапах работы, от сортировки образцов до выдачи результатов. Внедрение информационных и цифровых технологий вместе с аппаратными компонентами делает отечественные лаборатории готовыми к любым эпидемиологическим неожиданностям.
У беременных при подозрении на внутриутробные инфекции плода исследуют околоплодные воды и ткани плаценты. Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций: Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться; В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений; Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней; За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек; Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти; За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур сауны, бани и т. Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике. Отрицательный результат исследования свидетельствует об отсутствии инфекции в биологических материалах.
Положительный результат подтверждает наличие микроорганизмов, но для постановки точного диагноза необходимы сведения об их количестве. Ведь в нашем организме присутствуют условно-патогенные микробы, которые становятся причинами заболеваний только в результате активного роста и размножения.
Поесть можно максимум за 12 часов до забора крови. Диагностику следует отложить при повышении температуры. Что показывает тест на антитела? Наличие иммуноглобулинов означает, что пациент либо болеет сейчас, либо переболел коронавирусом недавно.
Если антитела отсутствуют, он либо не заражался никогда, либо микроорганизм попал в тело совсем недавно. Иммунный ответ формируется до двух недель. Данное исследование не стоит воспринимать как пробу на коронавирус. Если антитела к нему есть, значит, контакт с возбудителем был. Но их отсутствие нельзя однозначно трактовать как избегание вируса. Наличие антител и прививки Положительный результат описанного исследования еще не гарантирует невозможность повторного заражения.
Иммунитет формируется ориентировочно на полгода. Поэтому в регионах, где установлены ограничения, QR-коды выдаются не только привитым, но и переболевшим в течение последних шести месяцев. Однако присутствие иммуноглобулинов не отменяет необходимость вакцинации. Вопреки распространенному мифу, перед прививкой выяснять их количество не нужно. Дополнительная диагностика Перечисленные методы диагностики позволяют установить наличие в организме COVID-19 и иммунный ответ на него. Однако у разных людей заболевание протекает неодинаково: меняется набор симптомов, риски возникновения тех или иных осложнений.
Если у выздоровевшего пациента обнаружены антитела в достаточном количестве, это позволяет ему стать донором крови для лечения тяжелых больных. Для этого ему нужно пройти стандартную диагностику во избежание передачи иных вирусов реципиентам. Коротко обо всех методах диагностики коронавируса Мы рассмотрели возможные методы обнаружения коронавируса в организме, оценки его устойчивости к данному заболеванию. Подчеркнем, что наличие вируса и выявленные антитела к нему — не одно и то же, поэтому и показания к прохождению обследований отличаются. При появлении первых признаков ОРВИ, которую легко перепутать с коронавирусом, лучше сразу выбрать полимеразную цепную реакцию. На этом этапе важно выяснить, имеет место банальная простуда или более опасное заболевание.
ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
История открытия и разработка метода пцр Молекулярная биология началась с эры ДНК. ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК. Роль другого типа нуклеиновых кислот - РНК - сводилась к функции посредников, производимых на матрицах ДНК и направляющих синтез белков. Появление ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики. В 1953 г. Эта их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией.
Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов.
Она позволяет обнаружить, проанализировать и измерить специфические последовательности гена в образце ДНК пациента, не клонируя его и не прибегая к блоттингу. Анализ можно выполнять даже из нескольких клеток буккального эпителия после полоскания рта, из единственной клетки, взятой у 3-дневного эмбриона, содержащего четыре или восемь клеток, из спермы во влагалищном тампоне, полученном от жертвы изнасилования, или из капли сухой крови на месте преступления. Если построить график увеличения вещества, синтезированного в начале ПЦР, мы получим на полулогарифмическом графике прямую линию, показывающую, что объем продукта удваивается с каждым циклом.
Количество циклов, требуемых для достижения некоего произвольного порога, зависит от того, сколько шаблона первоначально присутствовало в начале ПЦР: чем меньше циклов необходимо для достижения данного порога, тем больше шаблона, по-видимому, присутствовало вначале. Важно, чтобы эффективность амплификации образца А и образца Б были сравнимыми, то есть два прямых сегмента на графике должны быть параллельными. Дата обновления публикации: 18.
К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК. То есть за один цикл ПЦР происходит увеличение количества генетического материала в два раза. Один цикл длится 2-3 минуты. Для образования достаточного количества генетического материала для идентификации, обычно производится 30-50 циклов ПЦР, что занимает 2-3 часа. Этап идентификации размноженного генетического материала Собственно ПЦР на этом заканчивается и далее идет не менее значимый этап идентификации. Для идентификации используют метод электрофореза или меченые «затравки». При использовании электрофореза полученные нити ДНК разделяются по размерам, и наличие фрагментов ДНК разной длины свидетельствует о положительном результате анализа то есть о наличии того или иного вируса, бактерии и т. При использовании меченых «затравок», к конечному продукту реакции добавляют хромоген краситель , вследствие чего ферментативная реакция сопровождается образованием окраски. Развитие окраски прямо свидетельствует, что вирус или другой выявляемый агент присутствуют в исходной пробе.
На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР. Это так называемаяreal-time ПЦР. Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью?
Специфичность и применение ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем ИППП. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов.
ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими это сделать невозможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды вода, почва и т. В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим комплементарен с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения гибридизации матрицы с праймером отжиг , последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.
Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями.
Содержание:
- ПЦР-исследования
- Преимущества метода ПЦР
- Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
- На чем основана диагностика при помощи ИФА
- Что показывает анализ ПЦР
Что такое анализ ПЦР?
Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке.
ПЦР анализ: что это такое?
ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах. Молекулярно-биологические исследования с применением метода полимеразной цепной реакций (ПЦР).
А как обнаружить скрытые инфекции у мужчин и женщин?
- Диагностика COVID-19: обзор основных методов
- Благоприятные сроки для диагностики ВИЧ
- ПЦР анализ – что это такое, как делают ПЦР анализ крови.
- Все под контролем! Правильный способ использования внутреннего контрольного образца (ВКО)
- СВЯЗАТЬСЯ С РЕДАКЦИЕЙ
- Методы диагностики ЗППП
История открытия современных методов молекулярной диагностики
Но для постановки окончательного диагноза необходимо использовать основной метод диагностики — иммунный блоттинг. Если результаты ИФА и иммунного блоттинга противоречат друг другу, то возможно проведение референс диагностики — анализ сразу двумя методами. К проведению ПЦР прибегают в исключительных случаях, так как это наиболее дорогостоящий метод исследования. Далее разберем каждый из методов диагностики более подробно. Визуально они выглядят как полоски, на поверхность которых наносят исследуемый биологический материал кровь, слюна. Для получения результата потребуется всего 10-15 минут, по истечении которых на тесте проявится, или цветная и контрольная полоска — положительный результат, подтверждающий наличие антител к ВИЧ, или только контрольная полоска — отрицательный результат. С недавнего времени американская компания OraSure Technologies наладила массовое производство экспресс-тестов для домашнего применения. Они отпускаются без рецепта, и при желании их может использовать каждый желающий. Однако необходимо учесть, что по точности диагностики ИХА уступает методу ИФА, а для постановки окончательного диагноза необходимо проведение иммуноблота. Скрининговый тест ИФА Принцип метода основан на способности искусственно созданных белков ВИЧ, улавливать вырабатывающиеся в организме человека специфические антитела. В результате взаимодействия, тест-система ИФА изменяет окрас индикатора.
Полученные изменения цвета обрабатываются с помощью аппаратуры, которая выдает результат анализа. При этом необходимо учесть, что скрининговый тест предназначен для выявления не ВИЧ как такового, а антител к нему. А поскольку для их появления в организме, необходимо время, то целесообразнее всего проводить скрининг спустя 3-6 недель после факта возможного инфицирования.
Современная тест-система без внутреннего контрольного образца — это абсурд.
Тем не менее почти половина! Конечно, ранее в условиях внезапной пандемии и нехватки времени, это можно было оправдать. Однако теперь, спустя месяцы, появились современные тест-системы с РНК в качестве ВКО и, естественно, предпочтительнее использовать их. Некоторые разработчики пошли еще дальше.
Пастера приложили все усилия, чтобы разработать тест-систему по всем правилам и мировым стандартам ПЦР-диагностики. Фаг, в свою очередь, защищает РНК от разрушения при взаимодействии с клиническим образцом, тем самым получается препарат армированной защищенной РНК коронавирусной инфекции.
Метод полимеразной цепной реакции предусматривает работу с любым генетическим материалом без подразделения по микробиологическим направлениям, что дает возможность организации централизованной ПЦР-лаборатории как отдельного структурного подразделения по различным направлениям деятельности.
Первые исследования проводились с элетрофоретической детекцией продуктов амплификации. Но полноценно в практику лабораторной диагностики метод ПЦР в нашем центре был внедрен с приобретением амплификаторов, с детекцией в режиме реального времени, с 2003г. На данный момент метод используется в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» в трех лабораториях: вирусологической, бактериологической и лаборатории особо опасных и природно-очаговых инфекций, по обширному кругу инфекций и для определения содержания ГМО в продуктах питания.
Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации загрязнения материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.
Словарь ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации.
В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. Процесс этот называется транскрипцией. Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка.
Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый A , содержащий аденин, гуаниновый G - гуанин, цитозиновый C - цитозин, тиминовый Т - тимин, урациловый U - урацил.
При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания. Праймер — котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи.
ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
полимеразная цепная реакция. Чтобы это сделать, мы разрабатываем ПЦР-тест, который будет «смотреть» конкретно этот вариант из всего генома, есть он у человека или нет. Анализ крови методом ПЦР. ПЦР (полимеразная цепная реакция) является одним из высокоточных методов, с помощью которого осуществляют диагностику инфекций различного характера, а в его основе лежит изучение генетических образцов материала человека.
Что такое ПЦР
Врачи берут фрагмент биологической жидкости или иную пробу, после чего с помощью специальных ферментов удлиняют, удваивают существующую ДНК. И так до тех пор, пока необходимая часть генетического материала не станет достаточно длинной для того, чтобы ее удалось обнаружить с помощью специального детектора. По результатам можно говорить о развитии того или иного инфекционного поражения, его давности. ПЦР используется не только для диагностики текущих септических процессов. Есть разные модификации способа. С помощью этого же метода, иммунологической разновидности, можно определить антитела к тому или иному агенту.
Благодаря чему, удается выявить сопротивляемость организма этому конкретному возбудителю, наличие или отсутствие иммунитета. Работа врачей заключается в том, чтобы верно толковать результаты. С помощью все того же ПЦР можно установить отцовство, определить присутствие наследственных генетических патологий. Это в своем роде уникальная и перспективная методика обследования. Показаний к назначению анализа полимеразной цепной реакции множество.
Вот лишь некоторые возможные варианты: Предполагаемые вирусные инфекции, поражающие печень. Все формы гепатита. На расстройство косвенно указывают такие симптомы: боли в правом боку, нарушения пищеварения, поносы, запоры, тяжесть под ребрами в проекции органа, пожелтение кожи и склер глаз, ощущение горечи во рту, тошнота, рвота, увеличение объемов живота. ПЦР позволяет поставить точку в вопросе. Назначается в первую же очередь.
Диагностика СПИДа. Определить ВИЧ инфекцию можно несколькими способами. Но полимеразная цепная реакция дает однозначный ответ, практически сразу. Потому именно ПЦР считается предпочтительным вариантом и основной мерой диагностики. Венерические инфекции.
Обследование проводится в любой момент. В качестве биоматериала забирают мазок со слизистых оболочек уретры. Методика предоставляет точные результаты. С ее же помощью можно обнаружить ход течения заболевания, давность, наличие иммунитета, сопротивляемость организма. Проводится параллельно с микробиологическим исследованием или вместо него.
Зависит от ситуации. На венерические инфекции указывают такие симптомы: боли в области половых органов, рези при мочеиспускании, жжение, зуд, выделения гнойного, прозрачного характера с неприятным запахом или без такового, нарушения отхождения урины. Герпесвирусные инфекции, папилломатоз. Другими способами определить патологические процессы, ассоциированные с этими возбудителями, не выйдет. Многие из них потенциально опасны.
Некоторые штаммы вируса папилломы человека крайне агрессивны, онкогенны. Могут привести к сложным формам рака. Потому так важна ранняя диагностика. Злокачественные процессы на начальной стадии.
Брок и Х. Фриз открыли Thermusaquaticus грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию. А в 1976 г. В 1983—1984 гг. Мюллисом был проведен ряд экспериментов по разработке ПЦР. Ученый первый начал использовать вместо ДНК-полимеразы устойчивую к высоким температурам Taq-полимеразу, что позволило ускорить работу по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллисом в соавторстве с Ф. Фалуном был разработан алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Метод продолжает развиваться, появляются новые модификации, но мы предлагаем рассмотреть методику проведения классической ПЦР. Методика полимеразной цепной реакции Метод постановки ПЦР требует наличия в реакционной смеси ряда основных компонентов: праймеры, Taq-полимераза, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, буфер, анализируемый образец. Праймеры — искусственно синтезируемые олигонуклеотиды, как правило, размером от 15 до 30 нуклеотидов, которые идентичны соответствующим участкам ДНК-мишени. Играют ключевую роль в амплификации, образуя продукты реакции. Для полимеразной цепной реакции последовательности праймеров очень важны, потому что реакционный цикл имеет определенные величины температур, используемые на этапах нагрева и охлаждения. Кроме того, большой избыток праймеров в реакционной смеси ПЦР приводит к тому, что они с большей вероятностью сталкиваются с частично комплементарным праймером, чем с полностью комплементарной ДНК матрицой. Таким образом, следует избегать комплементарностипраймеров друг другу. Этот фермент довольно часто используется при проведении стандартной ПЦР. Таким образом, она может оставаться активной после каждого из шагов денатурации. Для оптимального включения оснований в синтезируемую цепь ДНК их обычно добавляют к реакционной смеси ПЦР в эквимолярных количествах. Как правило, конечная концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 0,2 мМ. Буфер — смесь катионов и анионов используемая в определенной концентрации, обеспечивающая оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Значение рН буфера колеблется от 8,0 до 9,5 и стабилизируется Трис-HCl. Одним из компонентов буфера Taq-полимеразы является ион калия KCl , который способствует отжигу праймеров. Буферная концентрация ионов магния является еще одним важным фактором для правильного функционирования ДНК-полимеразы. Ионы магния служат кофактором для ДНК полимеразы. Анализируемый образец — вносимый в реакционную смесь препарат, обычно содержащий искомую ДНК, служащую мишенью для амплификации. В случае отсутствия ДНК-мишени продукт не образуется.
Словарь ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. Процесс этот называется транскрипцией. Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый A , содержащий аденин, гуаниновый G - гуанин, цитозиновый C - цитозин, тиминовый Т - тимин, урациловый U - урацил. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания. Праймер — котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. Литература Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. Искусственные генетические системы — М.
С другой стороны, программа держит в своих настройках тип биоматериала и направления на исследования, на основе чего составляет и выдает рабочее задание для персонала и оборудования. Когда образцы поступают в лабораторию, с них сканером штрих-кодов считываются данные, обрабатываются, и на этап экстракции формируется задание для сотрудников. Они устанавливают часть проб в станции выделения, а с другими работают вручную. После экстракции генерируется задание для амплификаторов, сотрудник загружает планшеты или пробирки и запускает прибор. После окончания амплификации выдаются результаты, которые уже проанализированы, а задача сотрудников — удостовериться в отсутствии ошибок. Вся информация уходит на сервер. Она может остаться на хранении, поступить в ЛИС, или же ее можно напечатать в лабораторный журнал и разослать в кабинеты врачей.
Принципы ПЦР-диагностики
В Роспотребнадзоре разъяснили, чем отличается тестирование на коронавирус методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) от экспресс-теста. Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека. Нельзя ПЦР или ИФА-диагностикой заменить все существующие методы исследования. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразная цепная реакция или ПЦР — это метод создания множества копий определенного участка ДНК in vitro (в пробирке, а не в организме).